為了確定神經回路的輸入輸出組織，本研究自主開發了TRIO(示蹤輸入組織與輸出組織之間的關系)和cTRIO(特殊性細胞大熱TRIO)方法。

TRIO鑒別A區的神經細胞，A區的神經元與B神經元之間有一種突觸聯系，并向C區投射。A-B連接是狂犬病病毒（簡稱RVdG）通過反向跨突觸示蹤引起的，是狂犬病病毒（簡稱RVdG）感染引起的一種新的神經退行性疾病。B區初始細胞可表達狂犬狂犬病毒糖蛋白（G）及TVA受體（TC），并于RVdG結合，使B區初始細胞與RVdG結合，使其能夠通過突觸傳遞至 A區前突觸神經元。

TRIO中TC、G基因的表達依賴于Cre，而B去則由AAV介導。Cre是一種重要的神經傳導蛋白，其功能主要是通過犬腺病毒2（簡稱CAV）介導。然而，TRIO無法分辨B區的各種細胞。

在cTRIO，將Cre酶的B區特異的細胞中進行表達。在B區域，TC、G的表達依賴于CAV-FLEx-loxP-Flp重組酶的特異性C區域。因此，只有能夠將Cre轉運至C區的B細胞才能作為RVdG跨突觸示蹤的初始細胞。

本研究采用TRIO及cTRIO分別對大鼠運動皮質（MC）進行干預。本項目擬通過體外培養和動物模型，將CAV-Cre注入MC，并用AAV-ELEx-loxP-TC/CG注入MC。結果顯示了MC第2/3層（L2/3）\L5（圖1F，左側；L6為初始細胞。）

cTRIO（cTRIO）將CAV-FLFxloxp-Flp注入Rbp4-Cre小鼠的cMC和延髓（Me），靶向定位于皮質內外的L5神經元。同時向MC內注入AAV-FLExFRT-T/G；這樣就會使初始細胞局限在MCL5（圖1F,中點和右邊)，正如Rbp4-Cre的表達模式所預測的那樣。

通過控制實驗，我們發現，在TRIO的CAV-Cre和cTRIO的CAV-FLFxloP-Flp、Rbp4-Cre中，狂犬病毒可以標記大部分長程傳入神經元。我們前期研究發現，與TRIO想比，cTRIO能將初始細胞限定在更多的亞群，且在皮層下及胼胝體向L5神經元同時接收來自丘腦或皮質的信息。TRIO同時也發現在大鼠的胼胝體和紋狀體中，有一種與肥大細胞相關的前突觸伴侶。

此外，我們還發現，CAV的擴散具體位置多在200um內，而且也有可能感染軸索通路。

我們前期研究發現，CAV-Cre在Ai4小鼠5個腦區分別注入CAV-Cre，發現在上述腦區投射的神經細胞（部分離注射點>1 cm）都得到了有效的標記。因而， CAV能夠遠距離侵染多種神經纖維的軸突及末梢。

目前已經確定了5個腦區：嗅球、聽皮層、海馬、小腦以及延髓，它們都能接收到藍斑核-去甲腎上腺素的投射。將CAV-Cre注入Ai14小鼠后，發現藍斑核內 NE （NE）能神經元。

相比后腦投射的LC-NE神經元，前腦投射的LC-NE神經元更偏向背側。

本研究為LC-NE神經元的突觸輸入了第一次全腦定量分析。

這項研究提供的病毒基因工具，也可用于研究哺乳動物腦內其它環路，如運動皮質。TRIO，尤其是 cTRIO，是對以往選擇性投射定位技術的拓展，使之可以應用于中樞神經系統的復雜回路分析。在此基礎上，我們還將使用CAV-FLFxloxp-Flp等多種 Cre轉基因小鼠，研究其交叉投射和細胞類型，從而實現對特定神經元群的調控。