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AAV 重慶宣尊生物科技有限公司
腺相關病毒AAV

【神經示蹤】AAV等病毒在神經示蹤領域的應用

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大腦神經網絡是由數目龐大、形態各異的神經元通過突觸連接構成的復雜結構,是大腦行使認知、記憶、感覺、情緒等功能的結構基礎。揭示大腦神經網絡結構,是最終理解大腦處理多種信息相關機制的基本前提。由此,神經示蹤技術應運而生。



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早在1873年,意大利科學家卡米洛·高爾基首創鉻酸鹽-硝酸染色法,將解剖所得組織中神經元和膠質細胞的胞體與突起染成棕黑色,而未被染色的細胞呈無色,并在光學顯微鏡下觀察、用手繪圖片記錄。這是人類最早研究神經通路的形態和神經元間的相互聯系的技術。20世紀80年代,Kristenseson將HSV1注射到小鼠排腸肌,發現他能通過坐骨神經感染脊神經背根節及脊髓背角,而將HSV1注入兔眼時,病毒順行感染視網膜節細胞、中腦上丘與外側膝狀體。


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近些年來,隨著基因技術的發展和綠色熒光蛋白(GFP)基因的發現與應用,加上一些新的免疫學技術的出現和發展,病毒以其特有的優點在神經環路示蹤方面的應用越來越廣泛。本文將對常用的病毒以及染料在神經環路示蹤方面的應用予以綜述。


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神經元是具有極性的細胞,因此神經環路示蹤技術包括順行標記、逆行標記、跨突觸標記與非跨突觸標記等方面。



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逆行示蹤

  如果要研究某個腦區是由哪個神經元來控制的,就需要反向追蹤。傳統的逆向示蹤方法有熒光染料標記、示蹤蛋白標記和辣根過氧化物酶(HRP)等。其中Fast blue,Fluorogold,霍亂,toxin b, 羰化青,retro beads等[1],HRP可以通過內吞途徑進入細胞內,經過一段時間后,取材,切片,染色,逆向標記神經元。

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病毒方面,II型犬腺病毒CAV-2與新血清型腺相關病毒rAAV2-retro可以通過軸突末端侵染神經元,從而使其載體通過包漿運輸在神經元胞體表達,結合熒光蛋白技術,進而實現逆向標記[2]。


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貳  順向示蹤



如果要研究某個腦區向哪個腦區進行對應的功能,就需要采用順行追蹤的方法。傳統的順行示蹤方法有麥角凝集素(WGA)、大豆凝集素(PHA)、生物素葡糖胺(BDA)等。


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病毒方面,直接在目標腦區注射帶有熒光蛋白載體的AAV,如AAV-hSyn-EYFP、AAV-DIO-ChR2-EYFP等等即可實現順向示蹤[5]。然而此種順向示蹤技術并不能排除路過某腦區而未形成突觸這一現象,需后續電生理記錄驗證。


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單純皰疹病毒(HSV、 VSV)和偽狂犬病毒(PRV)都能實現跨突觸的順行追蹤。2017年1月,美國南加州大學的李志強教授團隊首次報道了一種高滴度的 AAV 1型病毒,它可以在神經突觸中進行順行示蹤,并在此基礎上實現了攜帶載體的表達。


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結語:

示蹤是研究腦內神經環路的一種重要手段。本項目擬在前期工作的基礎上,通過基因工程、病毒追蹤等手段,通過基因重組、添加特定篩查標志、改變病毒感染特征等手段,實現對病毒株的定向改造,以及在基礎與臨床研究中的應用,是今后病毒追蹤的重要發展方向。




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