五分鐘了解//自噬LC3雙標腺病毒
A: 自噬是細胞內的一種“自食（Self-eating）”的現象，凋亡是“自殺（Self-killing）”的現象，二者共用相同的刺激因素和調節蛋白，但是誘發閾值和門檻不同，如何轉換和協調目前還不清楚. 自噬是指膜（目前來源還有爭議，大部分表現為雙層膜，有時多層或單層）包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體（autophagosome），最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autophagolysosome），降解其所包裹的內容物，以實現細胞穩態和細胞器的更新。
目前根據發生過程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。
細胞的整個區域被包圍在雙膜小泡的自噬體中，這些自噬體然后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，其內容物隨后被其中的蛋白酶降解。即我們說的自噬（autophagy）
是指溶酶體主動、直接吞噬胞漿成分的一種方式。
一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉位入溶酶體。通常說的自噬泛指Macroautophagy。
步驟1：細胞接受自噬誘導信號后，在胞漿的某處形成一個小的類似“脂質體”樣的膜結構，然后不斷擴張，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一個由2層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到，被稱為Phagophore，是自噬發生的鐵證之一。
步驟2：Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，包括細胞器，全部攬入“碗”中，然后“收口”，成為密閉的球狀的autophagosome，我把它翻譯為“自噬體”。電鏡下觀察到自噬體是自噬發生的鐵證之二。有2個特征：一是雙層膜，二是內含胞漿成分，如線粒體、內質網碎片等。
步驟3：自噬體形成后，可與細胞內吞的吞噬泡、吞飲泡和內體融合（這種情況不是必然要發生的）。
步驟4：自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內膜被溶酶體酶降解，2者的內容物合為一體，自噬體中的“貨物”也被降解，產物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。
正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，常用的工具藥有：
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
4) 利用Western Blot檢測p62蛋白來評價自噬以及自噬流的強弱:
起初自噬所降解的底物被認為是隨機的,但是后來的研究表明有些蛋白是seletively降解的,在這些蛋白之中研究的最為透徹的是蛋白p62,p62 is selectively incorporated into autophagosomes through direct binding to LC3 and is efficiently degraded by autophagy ; thus, the total cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity. (一般情況下p62蛋白水平的多少與自噬流的強弱有著反比例關系)
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