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狂犬病毒

狂犬病毒(RV)

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       狂犬病毒(Rabies Virus,RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)。其基因組是長約12 kb的單股負鏈RNA,由3′端至5′端依次排列著N、P、M、G和L共5個狂犬病毒的結構基因,分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質蛋白、糖蛋白和轉錄酶大蛋白(如圖1)。

圖1. RV粒子示意圖(圖片來自whelanlab網站)

 
       RV在宿主體內,病毒糖蛋白G介導病毒粒子與細胞表面受體結合,通過內吞作用進入細胞。隨后通過pH介導膜融合,促使RV基因組釋放到細胞質中。感染病毒粒子內包裝的L、N、P共同構成的聚合酶復合物以基因組負鏈RNA為模板啟動轉錄表達,復制,組裝,出芽產生子代病毒。(如圖2)

圖2. 狂犬病毒生命周期示意圖(圖片來自維基百科)

 
       野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子,在神經系統中具有傳播屬性,對人和動物均具有較高致病性。隨著反向遺傳學手段的成熟,經過改造的RV,可用于神經回路研究。RV感染中樞系統后,主要標記神經元,幾乎不標記膠質細胞;被感染的神經元在一定時間內(7-12天)幾乎不發生明顯病變及裂解。目前RV系統可分為逆向標記系統和逆向跨單突觸系統。

第一代逆向標記系統(RV-ΔG)

       RV的囊膜糖蛋白(glycoprotein,G)是其逆行跨突觸所必需的蛋白,G蛋白缺失的RV(RV-ΔG)會喪失跨突觸能力,但其復制及轉錄不受影響(可持續高豐度表達外源基因),因此,RV-ΔG攜帶報告基因后,可逆向高亮度標記神經元精細形態。

第二代逆向標記系統  [RV-N2c(G)-ΔG]

       CVS-N2c病毒株具有更低的神經毒性以及更強的跨突觸突觸傳遞能力,其G蛋白缺失的RV [RV-N2c(G)-ΔG] 能在更低的滴度達到與第一代RV-ΔG相同甚至更好的逆向標記效果,且神經毒性更低。

逆向跨單突觸系統(RV-EnvA-ΔG)

       利用重組的禽類肉瘤病毒(Aviansarcoma-leukosisvirus,ASLV)的外膜蛋白(EnvA)融合蛋白包裝RV形成的病毒粒子,可特異性識別EnvA的受體TVA(TVA只存在于禽類細胞中,在哺乳動物神經元中無表達)介導病毒特異性地感染細胞。利用Cre轉基因鼠結合Cre-LoxP控制表達TVA及G蛋白的AAV輔助病毒,可實現只在特定區域特異類型神經元中表達TVA及G蛋白,從而利用RV-EnvA-ΔG實現對特異類型神經元的逆向跨單級突觸標記(如圖3)。在此基礎上,使RV-EnvA-ΔG帶上ChR2及GCaMP等基因,可實現對特異類型神經元的直接輸出網絡進行功能操縱及活動監測。
圖3. RV-EnvA-ΔG實現神經元的逆向跨單級突觸標記(Callaway, et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 2015)

應用

1)特定區域特異類型神經元的全腦單級輸入網絡標記;(見案例展示二)
2)兩個區域特異類型神經元跨單級輸入網絡標記;(見案例展示一)
3)三級連接網絡的跨單突觸標記。

產品列表

布林凱斯RV系列產品分為RV-CVS株和SAD-B19疫苗株。 

RV-CVS株產品列表:

 

SAD-B19株產品列表:

 

案例展示

實例一:逆向標記海馬錐體神經元中同時作用于mPFC和ACB中的GABA能神經元(圖4,PMID: 31285615)

實驗動物:抑制性神經元(SST, PV, VIP)的Cre小鼠
使用的病毒:RV-EnvA-GFP,AAV-DIO-TVA-hBFP和AAV-DIO-RG
實驗方法和結果:在抑制性神經元(SST, PV, VIP)的Cre小鼠mPFC腦區注射RV-EnvA-GFP以及Cre依賴的輔助病毒AAV-DIO-TVA-hBFP和AAV-DIO-RG實現逆向跨單級突觸,同時在ACB腦區注射從軸突末梢吸收的RV-DG-DsRed,病毒逆向標記海馬體投射到ACB區的神經元,最終找到海馬體中同時調控mPFC和ACB區的GABA能神經元。(如圖4)

圖4. 標記海馬錐體神經元中同時作用于mPFC和ACB中的GABA能神經元

 

實例二VTA多巴胺能神經元分離的支配NAC和mOT(圖5,PMID: 29251597)

實驗動物:C57BL/6 mice
使用的病毒:RV-DG-DsRed和RV-DG-GFP,滴度10的8次方TU
實驗方法和結果:分別注入100 nl RV-DG-DsRed和RV-DG-GFP在NAC和mOT中,1周后灌流取材,可在VTA追蹤到神經元。

圖5. VTA多巴胺能神經元分離的支配NAC和mOT




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