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單純皰疹病毒

單純皰疹病毒

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單純皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科,有HSV-1和HSV-2兩種亞型。HSV基因組為約152 kb的線性雙鏈DNA,由共價連接的長片段(UL)和短片段(US)組成,每一片段均含單一序列和反轉重復序列,病毒感染宿主細胞后基因組會環化。HSV基因組中近一半為非必需基因,遺傳改造空間大,可將大片段外源基因或多個轉基因同時引入病毒基因組(圖1)。


圖1. HSV病毒粒子電鏡圖和基因組構成

 

       H129是一個HSV-1型病毒的臨床分離株,具有特異順向跨突觸的特性。經過多年在各種動物模型的活體測試中,發現其不僅能夠標記中樞不同腦區之間的連接,也能標記外周與中樞不同腦區的連接。經過改造的病毒,裝入熒光蛋白后可以實現高效、穩定的順行跨突觸標記神經元網絡的功能,適合于神經輸出環路的順行示蹤研究。HSV感染宿主范圍廣,在解析大/小鼠及非人靈長類及其他各種哺乳動物和禽類實驗動物的神經信息向下游輸出環路的研究中極具價值。
       依據實驗目的的不同可以分為3類:HSV擴增子、HSV順向跨多級突觸以及HSV順向跨單級突觸系統。


HSV擴增子

HSV-1擴增子載體為不含病毒結構蛋白,僅含有HSV-1的復制起始點ori和切割包裝信號pac以及外源基因表達盒的假病毒載體。具有以下特點:
1. 載容量大,其包裝能力可達150Kb;
2. 宿主細胞廣泛,既可感染分裂細胞又可感染非分裂細胞,包括中樞神經系統;
3. 不含編碼病毒結構蛋白的基因;
4. 不整合至宿主細胞;
5. 不含有HSV-1的致病基因,僅含有HSV-1基因組的復制起始點ori和切割包裝信號pac,具有很好的安全性;
6. 含有HSV-1外殼,具有天然的HSV-1嗜性等優勢。
這些優勢使得HSV-1擴增子載體成為一種十分有力的神經系統疾病基因治療載體,為中樞神經系統等多種系統疾病的基因治療開辟道路。


HSV順向跨多級突觸系統

       HSV-1型 H129株具有特異順向跨突觸的特性。病毒感染神經細胞后,在胞內復制并表達目的基因,子代病毒經軸突運輸到突觸前,跨突觸進入下游神經元,開始新一輪的復制及跨突觸傳播等過程。將熒光基因插入其基因組中后能達到順向跨多級突觸標記神經元的效果。

HSV順向跨單級突觸系統

       單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)在HSV感染神經細胞后的急性神經節復制和復發性潛伏性神經節感染中起到重要作用(Coen et al。, PNAS, 1989)。當HSV-TK缺失后,HSV-ΔTK能感染感染神經元,但是不能復制,進而失去了跨突觸的能力。在表達TK 的輔助病毒的存在下,HSV-ΔTK-hUbC-tdTomato可以從起始神經元傳播至突觸后的神經元,從而標記出一個給定腦區或特定類型神經元的直接下一級受支配神經元。順行一級跨突觸標記系統極大地促進直接輸出性神經網絡的研究。

圖2. 神經元順向跨單級標記示意圖

應用

1. HSV擴增子。
2. 利用HSV擴增子病毒載體可實現大片段載體基因(>5Kb)的過表達。
3. HSV順跨單級/多級突觸(見案例展示)
1) 研究大腦特定區域的全腦范圍多級輸出網絡結構。順行追蹤感知覺系統信息從外周向中樞輸入網絡,從低級腦區向高級腦區的信息輸出的網絡結構;從高級腦區向低級腦區反饋信息輸出的網絡結構;
2) 神經發育過程中的神經網絡變化;
3) 神經精神疾病模型中,大腦中樞及外周信息輸出神經網絡結構特征和異常變化;
4) 神經損傷及康復模型中,大腦中樞及外周信息輸出神經網絡的連接狀況的損傷程度和恢復程度;
5) 追蹤外周器官與中樞神經系統間的聯系通路(可能會有一定程度的潛伏)。

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案例展示

實例一:示蹤nRT-PV 神經元下一級直接支配的神經元

實驗動物:PV-cre 系小鼠
使用的病毒:H129-ΔTK-tdT 和輔助病毒AAV-DIO-TK-GFP
實驗方法和結果:在PV-cre小鼠nRT腦區先注射cre依賴的TK輔助病毒,3周后注射H129-ΔTK-tdT,然后一些小鼠在第25 天灌流取材,確定跨突觸的起始細胞;剩下的小鼠在第32 天取材,可以在多個腦區檢測到信號,這些腦區包括VP,Po,VM等。


圖3. 示蹤nRT-PV 神經元下游直接支配的細胞(來源于武漢病毒所江海飛博士論文)

 

實例二:Htr2c神經元直接支配EW神經元(圖3,PMID: 30104733)

實驗動物:Htr2c-Cre 系小鼠
使用的病毒:H129-ΔTK-tdT 和輔助病毒AAV-DIO-TK-GFP
實驗方法和結果:在Htr2c-Cre小鼠vCA1腦區注射順向跨單病毒,標記vCA1腦區Htr2c特異性神經元,一段時間后取材,可檢測到EW腦區神經元被標記上了紅色信號。表示EW區受上游vCA1腦區Htr2c神經元的直接支配。


圖4. vCA1腦區Htr2c神經元直接支配EW區神經元




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